前言
年新鲜出炉的欧易/鹿明生物合作客户复旦大学环境科学与工程系郑正教授课题组在JournalofHazardousMaterials期刊发表的题为“Biologicaltoxicityoffreshandrottenalgaeonfreshwaterfish:LC50,organdamageandantioxidantresponse”的研究成果，通过LC-MS非靶向代谢组学研究方法，检测了腐烂藻类溶液（RAS）的组成成分和其中的*性物质，探究了富藻水体对鱼类的致死机理。通过16SrRNA测序，发现经新鲜藻类溶液（FAS）和腐烂藻类溶液（RAS）处理后鱼类肠道微生物多样性和丰度的显著差异，探讨了由微生物的差异导致肠道微生物的失衡，炎症、吸收功能障碍，甚至鱼类死亡等问题。该研究为藻类*性的相关研究提供了依据。
中文标题：新鲜藻类和腐烂藻类对淡水鱼的生物*性：半数致死浓度、器官损伤和抗氧化反应
研究对象：草鱼，鲫鱼，鲢鱼
发表期刊：JournalofHazardousMaterials
影响因子：9.
发表时间：年
合作单位：复旦大学环境科学与工程系
运用欧易/鹿明生物技术：LC-MS非靶代谢组学(由鹿明生物提供技术支持)、16SrRNA测序(由欧易生物提供技术支持)
研究背景
近几十年来，富营养化导致的有害藻类大量繁殖使淡水生态系统中的生物被有*细胞和溶解的*素包围。这些生物不仅受到摄入蓝细菌和藻类*素的威胁，还受到相关水污染的影响。与陆生动物相比，水生生物更容易受到有害生物和藻类*素的影响，尤其是在水生食物网中处于较高营养水平的鱼类。有*蓝藻降解过程中，藻细胞壁破裂后，*素等物质释放到水中。这导致微囊藻*素浓度增加，对鱼类有*。藻*素在浮游动物、贻贝、甲壳类动物和鱼类等水生生物中累积，并可转移到高等脊椎动物体内，具有潜在的致死和亚致死效应。
先前的研究主要都集中在单一物质对水生生物的*性上，很少进行FAS和RAS的*性研究。本文研究了FAS和RAS的组成和*性，观察了FAS和RAS对鱼类的器官损伤，抗氧化反应和肠道微生物的影响，为藻类*性及其对水生生物危害相关领域的研究提供依据。
研究思路
研究方法
1.实验材料
新鲜藻类来自于太湖，腐烂藻类由新鲜藻类经超声、密封降解15天后过滤而得。实验对象为草鱼、鲫鱼和鲢鱼，均来自于太湖，在实验室淡水养殖两周。每种鱼类分为新鲜藻液组（FAS组）和腐烂藻液组（RAS组）。通过急*性实验，对三种鱼在藻类溶液中的安全浓度进行比较，将草鱼选为研究对象进行后续实验。
2.组学分析
LC-MS非靶向代谢组学实验(由鹿明生物提供技术支持)，16SrRNA测序(由欧易生物提供技术支持)
3.检测方法
（1）细胞密度检测：检测FAS和RAS的*性；
（2）镜检：观察受试鱼的器官损伤；
（3）抗氧化检测：通过检测SOD，CAT，GSH和MDA来评估有机污染物对草鱼的损害。
研究结果
1.FAS和RAS的组成和*性
在本研究中，作者研究了FAS和RAS的组成和*性。通过LC-MS非靶向代谢组分析RAS的组成，结果表明RAS的组成主要包括有机酸、酮类、多肽类、酯类、酚类、氨基酸类和代谢中间产物。其中微囊藻*素-LR(MC-LR)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DOP)和三苯基氧化膦(TPPO)具有生态*性。另外，DBP和DOP是增塑剂的常见成分，对水生生物具有急*性。
在本研究中，RAS中的*曲霉*素B1、呕吐*素和玉米赤霉烯酮的浓度分别为0.、9.和14.15g/L，而*曲霉*素B1对鲶鱼的半数致死浓度（LC50）为9.5-13.3mg/kg。本研究*曲霉*素B1的浓度低于该LC50值，表明鱼的死亡是由多种有*物质产生的有害作用引起的。
2.FAS和RAS对鱼类死亡率的影响
图1为FAS处理组和RAS处理组的急*性实验，通过相应的藻细胞密度来估计FAS和RAS的*性。作者分别计算了处理12小时、24小时、48小时、72小时和96小时后的死亡率。鲫鱼、草鱼和鲢鱼的死亡率随着相应的细胞密度而增加。此外，当细胞密度低于7.21×个细胞/升时，死亡率也随着处理时间的延长而增加。
图1
三种鱼类在FAS和RAS中的死亡率
（A）鲫鱼、草鱼和鲢鱼在新鲜藻液中死亡率、处理时间和藻细胞密度之间的关系。
（B）鲫鱼、草鱼和鲢鱼在腐烂藻液中死亡率、处理时间和藻细胞密度之间的关系。
半数致死浓度是受试生物对有*物质敏感性的指标，浓度越低则*性越大，三种鱼的RAS的半数致死浓度值都比FAS低一个数量级，表明RAS的*性更高（图2）。随着时间的增加，FAS的半数致死浓度变化比RAS更显著。作者认为可能的原因是鱼对RAS中有*物质的耐受性增加。此外，RAS中的有*物质可能会随着时间的推移而分解，导致实验后期*性增加较慢。而新鲜的藻细胞在细胞死亡后不断分泌代谢产物并释放有*物质，导致后期*性显著增加。
图2
FAS组和RAS组不同时间与半数致死浓度的多重拟合关系
（A-C）鲫鱼、草鱼和鲢鱼在新鲜藻液中不同处理时间和半数致死浓度的多重拟合关系。
（D-F）鲫鱼、草鱼和鲢鱼在腐烂藻液中不同处理时间和半数致死浓度的多重拟合关系。
3.FAS和RAS对草鱼器官的影响
作者通过显微镜，透射电镜观察了FAS和RAS对草鱼器官的影响。结果表明，与对照组相比，FAS组的鱼鳃中可观察到充血，并且在鳃丝之间发现藻类菌落，尤其是在鳃顶部。因此，藻类细胞的粘附严重影响鱼的呼吸，从而导致鱼的死亡。对于RAS组，鳃上没有观察到藻类，但整个鳃上出现了严重的出血和鳃丝粘连，导致鱼的窒息。研究发现FAS和RAS对鱼类的*性机制不同。
对肠道的观察表明，藻类可以通过摄入进入鱼的肠道。在RAS组中发现了肠的组织损伤和出血。同时，RAS中的一些有机物可能会对鱼类的肠粘膜和细胞结构造成损伤，导致肠道损伤或出血。
图3
显微镜下草鱼鳃和肠的照片
（AB）对照组的鳃及其圆圈部分放大图像；
（CD）FAS组中X5组的鳃及其圆圈部分放大图像；
（EF）RAS组中F5组的鳃及其圆圈部分放大图像；
（G）对照组的肠；
（H）FAS组中X5组的肠；
（I）RAS组中F5组的肠。
经透射电镜观察，发现FAS和RAS均对鳃细胞造成严重损伤，主要表现为细胞变形、内部结构破坏、细胞线粒体嵴断裂、自体溶酶体增加、细胞间物质增生、细胞核收缩或坏死。鳃细胞结构的变化会导致功能退化，这反过来将削弱鱼类从水中吸收溶解氧的能力，并加速鱼类的缺氧死亡。
图4
FAS组和RAS组的鱼鳃透射电镜图像(×)
（A）un:核；pv:胞质空泡；is:细胞间物质；iv:质膜内陷；cv:胞质液泡；om:外质膜；
（B）cv:细胞质液泡；m:线粒体；ly:溶酶体；o:成瘾滴；sg:分泌泡。
另外，作者在RAS组的鱼肚中发现寄生虫，观察到胆囊破裂。而FAS组中鱼的腹部是正常的，但鱼的肝脏和鳃呈暗红色，在鳃上发现小瓜虫。研究观察表明，FAS和RAS不仅通过器官损伤和呼吸系统破坏导致鱼类直接死亡，还通过增加疾病感染率导致其间接死亡。
图5
FAS组和RAS组的死鱼解剖图
（AB）RAS组的F5组；
（CD）RAS组的F4组；
（EF）FAS组的X5组；
（GH）FAS组的X4组。
4.不同处理时间FAS和RAS对草鱼氧化应激反应的影响
作者研究分析了FAS和RAS不同处理时间（1天、3天、5天、10天和15天）后草鱼的抗氧化反应。SOD在第5天达到最高值，显著高于其他时间，随后呈下降趋势。CAT与SOD变化趋势相似。GSH变化明显，第一天达到最高值。每次处理的值随着处理时间的增加而降低，并显著高于对照组。表明FAS和RAS引起草鱼氧化应激，抗氧化防御被激活以清除体内过量的氧自由基。
MDA含量在第一天达到最高值，并且高于其他时间。MDA浓度随着时间的延长而降低，表明氧化损伤随着抗氧化防御系统的激活而降低。SOD、CAT、GSH和MDA的变化证明了草鱼的抗氧化防御是由FAS和RAS诱导的。同时，该值随时间而变化，表明抗氧化反应是时间依赖性的。
图6
不同FAS和RAS处理天数对草鱼氧化应激反应的影响
(A)CAT过氧化氢酶；
(B)GSH谷胱甘肽；
(C)SOD超氧化物歧化酶；
(D)MDA丙二醛；
（O:空白对照组；A1,A2,A3:低,中,高水平的FAS*性处理；B1,B2,B3:低,中,高水平的RAS*性处理；C1,C2,C3:低,中,高水平的FAS和RAS混合*性处理）。
5.FAS和RAS对草鱼肠道微生物的影响
作者对草鱼肠的内容物进行16SrRNA测序，在FAS组中，主要肠道微生物是变形菌、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门（图7A）。在RAS组中，变形菌、厚壁菌门、拟杆菌门、梭杆菌门和放线菌门占优势（图7B）。经FAS和RAS处理后，鱼肠中微生物的多样性和丰度发生显著变化（图7C）。根据OUT数据，FAS组(T0-T3)和RAS组(S0-S3)的微生物多样性和优势菌种丰度差异显著(p0.05)。T3与T4、S3和S4的微生物多样性差异不显著(p0.05)。半透膜虽然未能改变微生物的多样性，但显著改变了鱼肠中微生物的优势菌种和相对丰度。这些结果表明鱼受到了藻类分泌和分解产生的溶解成分或小颗粒的影响。
在本研究中，FAS和RAS的处理导致肠道微生物结构从以变形杆菌为主转变为以厚壁菌门、拟杆菌门、梭杆菌门和放线菌门为主。这些变化可导致肠道微生物的失衡，并可导致炎症、吸收功能障碍，甚至宿主死亡。
图7
FAS组和RAS组的草鱼肠道微生物分布，top50_OTU_系统发育树热图
(A)FAS组草鱼肠道微生物群落分布；
(B)RAS组草鱼肠道微生物群落分布；
(C)top50_OTU_系统发育树热图；
（F0对照组；T1,T2,T3非微孔滤膜组，分别对应FAS低,中,高浓度；T4为高浓度FAS微孔滤膜组；S1,S2,S3为非微孔滤膜组，分别对应RAS低,中,高浓度；S4为高浓度RAS微孔滤膜组）。
研究结论
该研究在RAS中发现了生态*性化合物，检测到*曲霉*素B1、呕吐*素和玉米赤霉烯酮。发现多种有*物质的有害作用导致鱼类死亡。经藻类对鱼类的急*性研究，发现RAS的*性大约是FAS的15倍，根据物质对水生生物的*性等级划分将FAS定为低*性，而RAS为中*性。有*的藻类溶液导致所有受试鱼类鳃内充血、肠道损伤和高感染率。在细胞水平，观察到器官细胞的变形和内部结构的损伤。FAS和RAS处理激活了鱼类抗氧化防御系统，并引起肠道微生物结构的变化，使体内微生物平衡破坏，最终导致鱼类死亡。本文为藻类的*性等相关研究及其对水生生物的危害作用提供了依据。
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本研究用LC-MS非靶向代谢组学方法来研究藻类溶液的组成，及其对鱼类死亡率的影响。经16SrRNA测序方法分析鱼类肠道内微生物群落变化，进一步研究藻类及其分泌物与分解产物对鱼类的影响，从而研究藻类溶液致鱼类肠道微生物失衡的相关机制。这项基于非靶向代谢组学和16SrRNA测序的研究探究了藻类溶液对鱼类的*性效应，为藻类*性及其对水生生物危害的相关领域研究提供依据。
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参考文献：
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2.Fadrosh,D.W.,Ma,B.,Gajer,P.,Sengamalay,N.,Ott,S.,Brotman,R.M.,Ravel,J..Animproveddual-indexingapproachformultiplexed16SrRNAgenesequencingontheIlluminaMiSeqplatform.Microbiome,2(1),1-6.
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文章来源于鹿明生物